آموزش جامع تکنیک ژل الکتروفورز: تکنیکی کلیدی در زیستشناسی مولکولی
ژل الکتروفورز یکی از تکنیک‌های بنیادین و پرکاربرد در زیستشناسی مولکولی، بیوتکنولوژی و پزشکی است که برای جداسازی مولکولهای زیستی مانند اسیدهای نوکلئیک و پروتئینها بر اساس ویژگی‌های فیزیکی نظیر اندازه، بار الکتریکی یا ساختار فضایی استفاده میشود. این روش با اعمال جریان الکتریکی در یک ماتریس ژلی (مانند آگارز یا پلیآکریلآمید) مولکولها را تفکیک میکند و به دلیل دقت بالا و انعطاف‌پذیری، نقش کلیدی در تحقیقات علمی و تشخیص بیماریها ایفا میکند. در این مقاله، تاریخچه، اصول علمی، انواع ژل‌ها، روش‌های اجرا، نکات ایمنی، کاربردها و تکنیک‌های بهینه‌سازی ژل الکتروفورز بررسی می‌شوند.
تاریخچه ژل الکتروفورز: از کشف تا کاربردهای مدرن
در سال ۱۹۳۷، آرنه تیزلیوس (Arne Tiselius) بیوشیمیست سوئدی، نشان داد که ذرات دارای بار الکتریکی را میتوان بر اساس بار با استفاده از یک میدان الکتریکی از یکدیگر جدا کرد. واژه الکتروفورز از دو بخش “الکترو” به معنای بار الکتریکی و “فورز” به معنای حرکت تشکیل شده است و الکتروفورز به معنای حرکت مولکولهای دارای بار الکتریکی تحت تأثیر میدان الکتریکی است. تیزلیوس از یک محیط مایع استفاده کرد که به دلیل تأثیر گرانش و پخش (دیفیوژن) وضوح جداسازی کمتری داشت. این محدودیت باعث شد که در روش‌های مدرن، محیط‌های جامد مانند ژل‌های آگارز، استات سلولز و پلیآکریلآمید بهعنوان ماتریس‌های حمایتی جایگزین شوند. این ژل‌ها امکان جداسازی مولکولها به‌صورت باندهای مجزا را فراهم میکنند و دقت و وضوح جداسازی را به‌طور قابل‌توجهی افزایش داده‌اند.
اصول علمی ژل الکتروفورز: چگونه کار میکند؟
مکانیسم حرکت مولکولها در میدان الکتریکی
ژل الکتروفورز بر پایه حرکت مولکولهای باردار در یک میدان الکتریکی عمل میکند. بسیاری از مولکولهای زیستی مهم مانند اسیدهای آمینه، پپتیدها، پروتئینها، نوکلئوتیدها و اسیدهای نوکلئیک دارای گروههای قابل یونش هستند؛ بنابراین، در هر مقدار مشخصی از pH، این مولکولها به‌صورت ذرات الکتریکی باردار در محلول وجود دارند که می‌توانند یا به‌صورت کاتیون (بار مثبت) یا آنیون (بار منفی) باشند. تحت تأثیر میدان الکتریکی، این ذرات باردار بسته به نوع بار خالص خود به سمت کاتد (الکترود منفی) یا آند (الکترود مثبت) حرکت میکنند. سرعت حرکت مولکولها (v) با فرمول زیر محاسبه میشود: v=(E.q)/f در این فرمول، q بار خالص مولکول و f ضریب اصطکاک است. ضریب اصطکاک به عواملی مانند جرم مولکول، شکل آن، ویسکوزیته محیط و تخلخل ژل بستگی دارد؛ برای مثالDNA به دلیل توزیع یکنواخت بار منفی (ناشی از گروههای فسفات در هر نوکلئوتید)، رفتار قابل‌پیش‌بینی در ژل الکتروفورز دارد و امکان تخمین دقیق جرم مولکولی آن فراهم است؛ در مقابل پروتئینها به دلیل تنوع در بار و ساختار، رفتار متفاوتی نشان می‌دهند.
رفتار ماکرومولکول‌ها در ژل الکتروفورز
جداسازی DNA و RNA
DNA و RNA به دلیل وجود گروههای فسفات در ساختارشان، بار منفی یکنواختی دارند. این ویژگی باعث میشود جداسازی آنها عمدتاً بر اساس اندازه انجام شود. منافذ موجود در ژل یا ماتریکس همانند یک صافی عمل میکنند و به مولکولهای کوچکتر اجازه می‌دهند سریعتر از مولکولهای بزرگ‌تر به سمت آند (الکترود مثبت) حرکت کنند.
جداسازی پروتئینها
پروتئینها به دلیل تنوع در بار و ساختار، رفتار متفاوتی دارند. برای یکنواخت کردن بار و ساده‌سازی جداسازی، پروتئینها با دترجنتی به نام سدیم دودسیل سولفات (SDS) مخلوط می‌شوند. SDS ساختار پروتئینها را باز کرده، آنها را به شکل خطی درمی‌آورد و بار منفی یکنواختی به آنها میدهد؛ در نتیجه، جداسازی پروتئینها در ژل پلیآکریلآمید (SDS-PAGE) بر اساس جرم مولکولی انجام میشود.
نقش باندهای مولکولی در تحلیل نتایج
در نهایت، پس از جداسازی مولکولهای DNA، RNA یا پروتئین با استفاده از الکتروفورز ژل، باندهایی نمایان می‌شوند که نشان‌دهنده‌ی مولکول‌هایی با اندازه‌های مختلف هستند. برای تعیین اندازه مولکولهای موجود در یک نمونه، سایز مارکرهایی به عنوان نمونه استاندارد با اندازه‌های مشخص در همان ژل قرار می‌دهیم و با نمونه مقایسه می‌کنیم.
عوامل مؤثر بر تحرک الکتروفورزی در ژل الکتروفورز
اندازه، شکل و بار مولکول
تحرک با اندازه مولکول رابطه معکوس و با بار خالص آن رابطه مستقیم دارد؛ یعنی مولکولهای کوچکتر و با بار بیشتر تحرک بیشتری دارند. پروتئین‌های کروی ساختار فشرده‌تری دارند و در مقایسه با پروتئین‌های فیبری با وزن مولکولی مشابه، سریعتر حرکت میکنند. ذرات با بار منفی (آنیون‌ها) به سمت آند و ذرات با بار مثبت (کاتیون‌ها) به سمت کاتد حرکت میکنند.
شدت میدان الکتریکی
تحرک با گرادیان پتانسیل (ولتاژ) رابطه مستقیم و با مقاومت محیط رابطه معکوس دارد. ولتاژ بالا سرعت حرکت را افزایش میدهد، اما گرمای بیش‌ازحد میتواند وضوح باندها را کاهش دهد.
بافر در ژل الکتروفورز
بافر جریان الکتریکی را منتقل کرده و pH محیط را ثابت نگه می‌دارد. یونیزاسیون مولکول‌هایی مانند پروتئینها و اسیدهای آمینه به pH محیط بستگی دارد. تغییر در pH محیط میتواند جهت و سرعت مهاجرت را تغییر دهد. قدرت یونی بالای بافر میتواند مهاجرت نمونه را کند کند، زیرا یون‌های بافر جریان بیشتری را منتقل میکنند. قدرت یونی پایین نیز جریان کلی را کاهش داده و وضوح جداسازی را کم میکند.
محیط نگهدارنده در ژل الکتروفورز
اندازه منافذ ژل با غلظت آن رابطه معکوس دارد. ژل‌های با منافذ کوچکتر برای مولکولهای کوچکتر مناسب‌اند. تنظیم اندازه منافذ متناسب با ویژگی‌های مولکول مورد نظر برای دستیابی به وضوح بهینه ضروری است. محیطی که میل ترکیبی با مولکولهای نمونه داشته باشد میتواند سرعت مهاجرت را کاهش دهد و وضوح جداسازی را کم کند؛ برای مثال گروههای سولفات در pH قلیایی یا خنثی یونیزه شده و بار منفی کسب میکنند. با اعمال میدان الکتریکی، یون‌های OH مرتبط با این گروههای باردار منفی به سمت کاتد مهاجرت میکنند. این حرکت، حرکت نمونه به سمت آند را مختل کرده و میتواند وضوح جداسازی را کاهش دهد. این پدیده الکترواندوزموز نامیده میشود. استفاده از ژل آگارز با محتوای سولفات کم این مشکل را برطرف میکند.
انواع ژل‌ها در الکتروفورز: آگارز و پلیآکریلآمید
ژل آگارز در الکتروفورز
ژل آگارز از پلی‌ساکارید آگاروبیوز (ترکیبی از گالاکتوز و ۳,۶-آنهیدروگالاکتوز) استخراج‌شده از جلبک دریایی تشکیل شده است. این ژل به دلیل تخلخل یکنواخت و قابلیت تنظیم اندازه منافذ، برای جداسازی مولکولهای بزرگ مانند DNA و RNA (از چند صد جفتباز تا حدود ۲۰ کیلوباز) و پروتئین‌های با جرم مولکولی بالا بسیار مناسب است. برای قطعات DNA کوچکتر از ۱۰۰ جفتباز، ژل پلیآکریلآمید مناسب‌تر است. برای جداسازی قطعات DNA بزرگ‌تر از ۲۵ کیلوباز، از الکتروفورز میدان پالسی (PFGE) استفاده میشود. در این روش، جریان الکتریکی به‌صورت متناوب از جهت‌های مختلف اعمال شده و به قطعات بزرگ‌تر اجازه میدهد با تغییر جهت، خود را بازآرایی کنند و تفکیک شوند.
نحوه تهیه ژل آگارز برای الکتروفورز
پودر آگارز در بافر داغ (۵۵-۵۰ درجه سانتی‌گراد) حل شده و یک محلول ویسکوز تشکیل میدهد که در قالب ریخته میشود. پس از سرد شدن، از طریق پیوندهای هیدروژنی به ژل جامد تبدیل میشود. این ژل دارای حفره‌هایی است که اندازه آنها به غلظت آگارز بستگی دارد.
تنظیم غلظت ژل آگارز برای جداسازی بهینه
غلظت آگارز به‌صورت درصد وزنی/حجمی (w/v) نسبت به حجم بافر بیان میشود. بهعنوان مثال، حل کردن ۱ گرم آگارز در ۱۰۰ میلی‌لیتر بافر، یک ژل ۱٪ ایجاد میکند. غلظت آگارز معمولاً در بازه ۰.۳ تا ۳٪ قرار دارد. ژل‌هایی با درصد کمتر، تفکیک بهتری برای قطعات بزرگ‌تر فراهم میکنند، در حالی که ژل‌هایی با درصد بیشتر، شناسایی قطعات کوچکتر را تسهیل میکنند.
نقش رنگهای ردیاب در رصد حرکت DNA
حرکت DNA با ردیابی رنگهای ردیاب موجود در بافر بارگذاری قابل‌مشاهده است. رنگهای ردیاب مانند بروموفنول بلو و زایلن سیانول با سرعت‌های استاندارد در ژل حرکت میکنند و امکان تخمین مسافت طی‌شده توسط قطعات DNA را فراهم میکنند. برای تعیین دقیق اندازه قطعاتDNA جدا شده، میتوان لگاریتم وزن مولکولی باندهای استاندارد DNA را در برابر مسافت طی‌شده توسط هر باند رسم کرد. استاندارد DNA شامل مخلوطی از قطعات DNA با اندازه‌های مشخص است که میتوان آنها را با نمونه‌های ناشناخته مقایسه کرد. نکته مهم این است که اشکال مختلف DNA (مانند سوپرکویل، خطی و حلقوی باز) با سرعت‌های متفاوتی در ژل حرکت میکنند. DNA پلاسمیدی سوپرکویل به دلیل ساختار فشرده‌اش سریعتر حرکت میکند، درحالی‌که DNA خطی با همان اندازه کندتر و شکل DNA حلقوی باز کندتر از همه حرکت میکند.
ژل پلیآکریلآمید: ساختار و ویژگی‌ها
ژل پلیآکریلآمید از پلیمریزاسیون آکریلآمید و بیسآکریلآمید در حضور آمونیوم پرسولفات، TEMED و ریبوفلاوین تحت تابش اشعه ماوراءبنفش تشکیل میشود. TEMED سرعت تشکیل رادیکال‌های آزاد از پرسولفات را افزایش میدهد و این رادیکال‌های آزاد به نوبه خود پلیمریزاسیون را کاتالیز میکنند. رادیکال‌های آزاد پرسولفات، مونومرهای آکریلآمید را به رادیکال‌های آزاد تبدیل کرده که با مونومرهای غیرفعال واکنش داده و زنجیره پلیمریزاسیون را آغاز میکنند. زنجیره‌های پلیمری در حال رشد، به‌صورت تصادفی پیوندهای متقاطع تشکیل می‌دهند و در نهایت ژلی با تخلخل مشخص تولید میشود.
ویژگی‌های ژل پلیآکریلآمید: نقش عوامل اتصال‌دهنده
الکتروفورز ژل پلیآکریلآمید (PAGE) از مخلوطی از آکریلآمید و یک عامل اتصال‌دهنده متقاطع، معمولاً بیسآکریلآمید یا متیلن بیسآکریلآمید استفاده میکند. سایر عوامل اتصال‌دهنده مانند پیپرازین دی‌آکریل‌آمید (PDA)، بیس آکریلوئیل سیستامین (BAC) و دی‌آلیل‌تارتاردی‌آمید (DATD) نیز قابل استفاده هستند. PDA در SDS-PAGE و رنگآمیزی نقرهای به کار می‌رود، زیرا باعث کاهش نویز زمینه، افزایش وضوح و افزایش مقاومت مکانیکی ژل میشود. BAC در PAGE برای بازیابی پروتئین‌هایی که پیوندهای دی‌سولفیدی ندارند یا برای بازیابی اسیدهای نوکلئیک مورد استفاده قرار می‌گیرد. DATD امکان حل شدن ژل‌ها را از طریق اکسیداسیون با اسید پریودیک فراهم میکند.
کنترل اندازه منافذ در ژل پلیآکریلآمید
اندازه حفره‌های ژل توسط دو عامل تعیین میشود: غلظت آکریلآمید و میزان عامل اتصال‌دهنده متقاطع. اندازه منافذ ژل را میتوان با تنظیم غلظت مونومرها به‌دقت کنترل کرد. این ژل برای آنالیت‌های مختلف مانند پروتئینها، پپتیدها، اسیدهای نوکلئیک و نوکلئوتیدها استفاده میشود و وضوح عالی را به دلیل غربال مولکولی بهتر و تعامل کم نمونه با ماتریس ارائه میدهد. این ژل‌ها به دلیل استحکام مکانیکی بالا و تخلخل قابلکنترل، برای جداسازی پروتئینها و اسیدهای نوکلئیک با دقت بالا مناسب هستند. نسبت آکریلآمید به بیسآکریلآمید معمولاً برای پروتئینها ۴۰:۱ و برای DNA 19:1 است.
دناتوراسیون پروتئینها در SDS-PAGE
اگر محلول پروتئینی به‌طور مختصر در سدیم دودسیل سولفات (SDS) و مرکاپتواتانول حرارت داده شود، پروتئین‌های موجود در محلول دناتوره شده و بار منفی یکنواختی کسب میکنند که بار طبیعی پروتئین را می‌پوشاند. این فرآیند زنجیره‌های پلی‌پپتیدی با نسبت بار به جرم ثابت و شکل یکنواخت تولید میکند. در این شرایط، تحرک الکتروفورزی به تعداد اسیدهای آمینه و جرم زنجیره‌های پلی‌پپتیدی بستگی دارد.
رنگآمیزی ژل: روشها و مواد مورد استفاده
پس از انجام الکتروفورز، ژل به منظور مشاهده مولکول مورد نظر رنگآمیزی میشود. بعد از رنگآمیزی، ژل تحت نور با طول موج مناسب تصویربرداری میشود.
اتیدیوم بروماید: رنگ رایج برای DNA و RNA
اتیدیوم بروماید رایجترین رنگ برای DNA و RNA به دلیل حساسیت بالا و هزینه کم است. این ماده با قرار گرفتن بین بازهای DNA، تحت نور UV فلورسانس ایجاد میکند، اما به دلیل جهشزایی، نیاز به احتیاط دارد.
SYBR Green و SYBR Gold: جایگزین‌های ایمنتر
SYBR Green و SYBR Gold حساسیت بالا و سمیت کمتر نسبت به اتیدیوم بروماید دارند، اما گران‌تر هستند. این رنگهای جایگزین معمولاً نمی‌توانند مستقیماً به ژل اضافه شوند و نیاز به رنگآمیزی پس از الکتروفورز دارند.
رنگآمیزی نقره: روشی با حساسیت بالا
رنگآمیزی نقره حساسترین روش برای پروتئینها و DNA است، اما نیاز به مراحل دقیق و مواد شیمیایی مانند فرمالدهید دارد.
نکات ایمنی در ژل الکتروفورز
در هنگام تهیه ژل الکتروفورز، آماده‌سازی بافر، راه‌اندازی دستگاه، اجرای الکتروفورز، رنگآمیزی و مشاهده آنالیت، رعایت احتیاط ضروری است.
خطرات آکریلآمید و نحوه کار ایمن
مونومرهای آکریلآمید نوروتوکسین و مشکوک به سرطان‌زایی هستند. باید با دستکش و در هود کار شوند. کاتالیزور به‌کاررفته در تهیه ژل پلیآکریلآمید در صورت تماس میتواند باعث آسیب ناشی از رادیکال‌های آزاد به پوست شود. هنگام کار با آن باید از دستکش استفاده شود.
احتیاط در کار با اتیدیوم بروماید
اتیدیوم بروماید با قرار گرفتن بین بازهای DNA به‌صورت وابسته به غلظت عمل میکند و شدت رنگآمیزی آن امکان تخمین مقدار DNA در هر باند را فراهم میکند. بااین‌حال، به دلیل بار مثبت این ماده، سرعت حرکت DNA در ژل حدود ۱۵٪ کاهش می‌یابد. اتیدیوم بروماید بهعنوان یک ماده مشکوک به جهشزایی و سرطان‌زایی شناخته میشود؛ بنابراین باید با احتیاط و با استفاده از دستکش کار شود. همچنین، این ماده بهعنوان زباله خطرناک طبقه‌بندی شده و باید به‌طور مناسب دفع شود.
رنگهای جایگزین برای کاهش خطرات
رنگهای جایگزین برای DNA در ژل‌های آگارز شامل SYBR Gold، SYBR Green، کریستال ویولت و متیل بلو هستند. از این میان، متیل بلو و کریستال ویولت نیازی به نور UV برای مشاهده باندهای DNA ندارند، که این امر خطر جهشزایی را در صورت استخراج DNA از ژل کاهش میدهد. بااین‌حال، حساسیت این رنگ‌ها کمتر از اتیدیوم بروماید است.
خطرات نور UV و محافظت از چشم
قرار گرفتن مستقیم چشم در معرض نور فرابنفش هنگام مشاهده ژل میتواند به چشم آسیب برساند.
کاربردهای ژل الکتروفورز در علم و پزشکی
تشخیص بیماریها
تحلیل دقیق الگوهای الکتروفورزی به پزشک کمک میکند تا علت اصلی ظهور یک مولکول غیرعادی یا فقدان یک مولکول طبیعی را تشخیص دهد. تفسیر صحیح نتایج الکتروفورز نقش کلیدی در تشخیص بسیاری از بیماری‌های ژنتیکی، ایمنی و خونی دارد.
پزشکی قانونی
انگشتنگاری DNA تکنیکی است که توسط متخصصان پزشکی قانونی به کار گرفته میشود. DNA به‌دست‌آمده از صحنههای جرم را با DNA مظنونان یا قربانیان مقایسه میکند. علاوه بر این، انگشتنگاری DNA برای تأیید هویت والدین بیولوژیکی کودک مورد استفاده قرار می‌گیرد.
تحقیقات علمی و کاربردهای مولکولی
به عنوان مرحله‌ای در توالی‌یابی DNA، ساترن بلات و وسترن بلات، RFLP و آنالیز پروتئینها از الکتروفورز استفاده میشود.
طراحی دارو و پروتئومیکس
بررسی برهم‌کنش‌های مولکولی و تحلیل ساختار پروتئینها از کاربردهای دیگر ژل الکتروفورز است.
نکات بهینه‌سازی برای ژل الکتروفورز موفق
انتخاب ژل با خلوص بالا
برای دستیابی به نتایج دقیق از ژل آگارز با خلوص بالا برای کاهش الکترواندوزموز استفاده کنید.
تنظیم غلظت ژل بر اساس اندازه مولکول
غلظت ژل را متناسب با اندازه مولکول تنظیم کنید (ژل‌های با درصد پایین برای مولکولهای بزرگ‌تر).
استفاده از استانداردهای مولکولی
از استانداردهای مولکولی با اندازه مشخص برای مقایسه دقیق استفاده کنید.
کنترل دما و ولتاژ
دما و ولتاژ را کنترل کنید تا از گرمای بیش‌ازحد و پخش باندها جلوگیری شود.
توجه به اشکال مختلف DNA
برای DNA، از اشکال مختلف (سوپرکویل، خطی، دایره‌ای باز) آگاه باشید، زیرا سرعت حرکت آنها متفاوت است.
نتیجه‌گیری: اهمیت ژل الکتروفورز در زیستشناسی مولکولی
ژل الکتروفورز یک تکنیک قدرتمند و ضروری در زیستشناسی مولکولی است که امکان جداسازی و تحلیل دقیق مولکولهای زیستی را فراهم میکند. با استفاده از ژل‌های آگارز و پلیآکریلآمید، پژوهشگران می‌توانند DNA، RNA و پروتئینها را بر اساس اندازه و بار تفکیک کنند. این روش در تشخیص بیماریها، تحقیقات علمی، پزشکی قانونی و طراحی دارو کاربرد گسترده‌ای دارد. این تکنیک نه‌تنها در تحقیقات پایه بلکه در طراحی دارو و آزمایشگاه‌های تحقیق و توسعه مورد استفاده قرار می‌گیرد.
منابع
Lee, Pei Yun et al. “Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.” Journal of visualized experiments : JoVE,۶۲ ۳۹۲۳. ۲۰ Apr. 2012, doi:10.3791/3923
https://www.genome.gov/genetics-glossary/Electrophoresis
Minden, Jonathan S et al. “Difference gel electrophoresis.” Electrophoresis 30 Suppl 1 (2009): S156-61. doi:10.1002/elps.200900098
https://www.nature.com/scitable/definition/gel-electrophoresis-286/
Duncan R. Smith , Basic DNA and RNA Protocols, Agarose Gel Electrophoresis, Springer Protocols, (1996), DOI: ۱۰.۱۳۸۵/۰-۸۹۶۰۳-۴۰۲-X:17
https://www.jove.com/v/5057/dna-gel-electrophoresis-concept-procedure-and-applications
Gel Electrophoresis – Principles and Basics Edited by Dr. Sameh Magdeldin, Publisher InTech, 2012.
Santos-Hernández, I. Recio, L. Amigo, Electrophoresis, Editor(s): Paul L.H. McSweeney, John P. McNamara, Encyclopedia of Dairy Sciences (Third Edition), Academic Press, 2022, Pages 370-381, ISBN 9780128187678, https://doi.org/10.1016/B978-0-12-818766-1.00115-X.
Chevalier, Analytical Methods | Electrophoresis, Editor(s): John W. Fuquay, Encyclopedia of Dairy Sciences (Second Edition),Academic Press, 2011, Pages 185-192, ISBN 9780123744074, https://doi.org/10.1016/B978-0-12-374407-4.00017-0.
