اصول PCR به زبان ساده

تکنیک های آزمایشگاهی / از

اصول PCR به زبان ساده​

اصول PCR به زبان ساده​، آموزش پی سی ار pcr

PCR؛ از آزمایشگاه تا زندگی روزمره

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز یا همان PCR، دیگر فقط یک ابزار تخصصی در آزمایشگاه‌های تحقیقاتی نیست؛ این فناوری اکنون در دل تشخیص‌های پزشکی، بررسی‌های ژنتیکی و حتی پرونده‌های جنایی حضور دارد. از زمان ابداعش، PCR مسیر طولانی‌ای را طی کرده و زمینه‌ساز نوآوری‌های بزرگی شده است. در این گزارش، نگاهی داریم به اصول PCR؛ از آزمایشگاه‌های تحقیقاتی گرفته تا کاربردهای تجاری، و از بیماری‌های همه‌گیر تا تشخیص‌ جهش های نقطه‌ای. شاید جالب باشد بدانید که همین تکنولوژی، ستون اصلی تست‌های تشخیص کرونا بود و امروز هم به عنوان قلب تپنده سیستم‌های پیشرفته “از نمونه تا پاسخ” شناخته می‌شود.

کشف بیماری ژنتیکی تا انقلاب در تشخیص پزشکی

نخستین کاربرد عملی PCR به شناسایی جهش در ژن HBB بازمی‌گردد؛ همان ژنی که عامل کم‌خونی داسی‌شکل است. در این پروژه، محققان از ترکیب الیگونوکلئوتیدهای نشاندار رادیواکتیو و آنالیز برشی برای ردیابی جهش‌های ارثی بهره گرفتند. از همین رو، ژن گلوبین به‌عنوان نخستین هدف برای تکثیر آنزیمی انتخاب شد. این تجربیات پایه‌ای، بعدها به تحلیل آلل‌های ژن HLA-DQ و توسعه روش‌های تایپ ژنی در این ناحیه‌ی چندآلل منجر شد؛ روشی که در پیوند اعضا و پزشکی قانونی کاربرد پیدا کرد.

با گسترش PCR، کاربردهای بالینی آن نیز شکوفا شد؛ به‌ویژه در ژنتیک پزشکی و میکروبیولوژی، برای شناسایی عفونت‌های ویروسی و باکتریایی. یکی از نقاط عطف، کشف توانایی PCR در تولید هم‌زمان محصولات با طول‌های متفاوت در یک واکنش واحد بود؛ چیزی که امروز با نام PCR چندگانه یا multiplex PCR می‌شناسیم. این تکنیک در ابتدا برای شناسایی حذف‌های ژن DMD، یکی از بزرگ‌ترین ژن‌های انسانی که روی کروموزوم X قرار دارد، استفاده شد؛ ژنی که جهش در آن منجر به دیستروفی عضلانی دوشن-بکر در مردان می‌شود.

در سال‌های بعد، روش‌های تشخیصی متعددی بر پایه همین اصل بنا نهاده شدند؛ مانند تشخیص هم‌زمان پلی‌مورفیسم F2 و جهش F5 لیدن. امروزه نیز، تهیه کتابخانه‌هایی از پنل‌های بزرگ ژنی برای توالی‌یابی نسل جدید (NGS)، بر پایه PCRهای فوق‌العاده چندگانه انجام می‌شود.

اصول PCR

از یک سلول تا صدها کاربرد: پیشروی PCR در علوم جنایی و پزشکی تولیدمثل

نقطه‌ی عطف در تاریخ PCR زمانی رقم خورد که پژوهشگران توانستند DNA را از یک تک‌سلول اسپرم تقویت کنند. این پیشرفت انقلابی، دروازه‌ای نو به روی استفاده‌های گسترده‌تر از PCR در حوزه‌های پزشکی قانونی و کمک‌باروری گشود؛ جایی که تحلیل مواد ژنتیکی تنها از یک یا چند سلول انجام می‌شود.

ورود رسمی PCR به عرصه‌ی پزشکی قانونی با موفقیت در انجام multiplex PCR روی شش ناحیه‌ی مینی‌سَتِلایت با تنوع ژنتیکی بالا آغاز شد. در این مطالعات، تنها چند نانوگرم‌ از DNA انسانی برای تحلیل کافی بود و نتایج با دقت بالا تکرارپذیر بودند. این روند به توسعه تحلیل‌های میکروستِلایت چندگانه منجر شد؛ همراه با رنگ‌آمیزی نقره‌ای محصولات PCR در ژل پلی‌آکریل‌آمید و مقایسه‌ی طول آنها با مارکرهای آللی. مرحله‌ی بعدی، استفاده از برچسب‌های فلورسنت و جداسازی این محصولات با الکتروفورز مویین بود؛ تکنیکی که امکان کار با DNAهای بسیار تخریب‌شده را نیز فراهم کرد. این روش امروزه به هسته‌ی اصلی روندهای کاری در آزمایشگاه‌های پزشکی قانونی تبدیل شده است.

تحولی دیگر در سال ۱۹۹۳ رخ داد، با معرفی روشی برای پایش زنده‌ی واکنش PCR در حین انجام آن. این تکنیک، که به qPCR یا PCR کمی معروف است، امکان اندازه‌گیری دقیق میزان نوکلئیک‌اسیدها را فراهم کرد. ترکیب این روش با رونویسی معکوس (RT) پیش از چرخه‌های حرارتی، باعث شد PCR به ابزاری ایده‌آل برای مطالعه RNA تبدیل شود؛ تکنیکی که با عنوان RT-PCR یا qRT-PCR شناخته می‌شود و به‌سرعت به استاندارد طلایی تحلیل‌های کمی تبدیل گشت.

تا امروز، سه روش پایه برای PCR داریم: PCR نقطه‌پایانی، PCR کمی (qPCR) و PCR دیجیتال (dPCR). البته، گونه‌های دیگری نیز توسعه یافته‌اند؛ از جمله bridge PCR که در شکل‌های پیشرفته‌ی تحلیل ژنوم مورد استفاده قرار می‌گیرد. در ادامه در مورد تمامی مطالب صحبت خواهیم کرد.

اصول PCR

تعریف PCR و اهمیت آن

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR: Polymerase Chain Reaction) یکی از بنیادی‌ترین و تأثیرگذارترین تکنیک‌های زیست‌شناسی مولکولی در قرن بیستم است که امکان تکثیر سریع، دقیق و هدفمند نواحی خاصی از DNA را فراهم می‌کند. این روش در سال ۱۹۸۳ توسط دکتر کری مولیس ابداع شد و به‌سرعت جایگاهی کلیدی در حوزه‌هایی نظیر تحقیقات ژنتیکی، تشخیص‌های پزشکی، بیوتکنولوژی، پزشکی قانونی و حتی باستان‌شناسی پیدا کرد. ویژگی‌هایی مانند سادگی اجرا، سرعت بالا، و نیاز به مقدار بسیار اندک DNA اولیه باعث شده‌اند که PCR به ابزاری رایج و ضروری در اغلب آزمایشگاه‌های پژوهشی و تشخیصی تبدیل شود.

PCR با ایجاد میلیون‌ها نسخه از یک ناحیه‌ی خاص DNA در مدت‌زمانی کوتاه، امکان تحلیل ژنتیکی دقیق را حتی از مقادیر ناچیز DNA فراهم می‌کند. این ویژگی‌ها، PCR را به ابزاری بی‌رقیب در موقعیت‌هایی تبدیل کرده‌اند که دقت، حساسیت و سرعت بالا اهمیت دارند.

 

اصول PCR پی سی ار ژنتیک ژن زیست

مبانی عملکرد PCR: نقش کلیدی پرایمرها

نوآوری اساسی در روش PCR استفاده از دو «پرایمر» اختصاصی است که در دو سوی توالی هدف قرار می‌گیرند. در صورت استفاده از تنها یک پرایمر، در هر چرخه فقط یک نسخه جدید از DNA ساخته می‌شود، اما با استفاده از دو پرایمر، واکنش وارد یک چرخه‌ی زنجیره‌ای می‌شود که در آن تعداد نسخه‌ها به‌صورت نمایی افزایش می‌یابد: یک نسخه به دو، دو به چهار، چهار به هشت، و به همین ترتیب.

جهت‌گیری پرایمرها نیز نقشی حیاتی دارد. هر پرایمر به یکی از دو رشته‌ی مکمل DNA در دو انتهای ناحیه‌ی هدف متصل می‌شود و آنزیم DNA پلیمراز تنها می‌تواند در جهت ۵′ به ۳′ نوکلئوتیدها را اضافه کند. بنابراین پرایمرها باید به‌گونه‌ای طراحی شوند که پلیمراز بتواند از آن‌ها آغاز کرده و DNA را به‌سمت یکدیگر گسترش دهد.

پرایمرها به‌صورت مصنوعی سنتز می‌شوند و اختصاصی بودن آن‌ها برای ناحیه‌ی موردنظر، عامل اصلی در دقت PCR است. در صورتی که توالی DNA اطراف ناحیه‌ی هدف شناخته شده باشد، می‌توان تقریباً هر ناحیه‌ای از ژنوم را به‌طور انتخابی تکثیر کرد. تنها محدودیت عملی، طول قطعه‌ی هدف است که معمولاً در محدوده‌ی صد تا چند هزار نوکلئوتید بهترین بازده را دارد.

اصول PCR پی سی ار ژنتیک ژن زیست

اجزای مورد نیاز برای انجام PCR

برای اجرای موفق واکنش PCR، به ترکیب دقیقی از اجزای مختلف نیاز است که هرکدام نقش کلیدی در فرآیند تکثیر DNA ایفا می‌کنند:

  1. DNA قالب (Template DNA):
    قطعه‌ای از ماده ژنتیکی که حاوی توالی هدف مورد نظر برای تکثیر است. کیفیت و خلوص بالای DNA قالب تأثیر مستقیمی بر موفقیت PCR دارد.

  2. پرایمرها (Primers):
    دو توالی کوتاه نوکلئوتیدی (حدود ۱۸ تا ۳۰ نوکلئوتید) که مکمل دو انتهای ۵′ و ۳′ ناحیه هدف هستند. پرایمرها مسیر تکثیر را مشخص کرده و آغازگر سنتز DNA توسط آنزیم هستند.

  3. نوکلئوتیدهای آزاد (dNTPs):
    چهار نوع نوکلئوتید (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) به‌عنوان مصالح اصلی برای ساخت رشته جدید DNA توسط آنزیم DNA پلیمراز به کار می‌روند.

  4. آنزیم DNA پلیمراز:
    آنزیمی مقاوم به حرارت بالا که وظیفه دارد نوکلئوتیدها را به توالی در حال سنتز اضافه کند. رایج‌ترین آنزیم مورد استفاده در PCR، Taq polymerase است که از باکتری Thermus aquaticus استخراج می‌شود.

  5. بافر واکنش (Reaction Buffer):
    محلولی که محیط یونی مناسب را فراهم می‌کند، pH سیستم را در محدوده‌ی بهینه نگه می‌دارد و شرایط لازم برای عملکرد صحیح آنزیم را تأمین می‌نماید.

  6. یون منیزیم (MgCl₂):
    یک کوفاکتور ضروری برای فعالیت آنزیم DNA پلیمراز است. غلظت مناسب Mg²⁺ نقش تعیین‌کننده‌ای در بازده و اختصاصیت PCR دارد.

اصول PCR پی سی ار ژنتیک ژن زیست

مراحل انجام واکنش PCR

فرآیند PCR از یک سری چرخه‌های حرارتی تشکیل شده است که هر چرخه شامل سه مرحله‌ی اصلی زیر است:

  1. دناتوراسیون (Denaturation):
    در این مرحله، نمونه به دمای حدود ۹۴ تا ۹۵ درجه‌ی سانتی‌گراد گرم می‌شود تا پیوندهای هیدروژنی بین دو رشته‌ی DNA شکسته شده و آن‌ها از یکدیگر جدا شوند.

  2. اتصال پرایمرها (Annealing):
    دما کاهش می‌یابد (معمولاً بین ۵۰ تا ۶۵ درجه‌ی سانتی‌گراد بسته به نوع پرایمر) تا پرایمرها بتوانند به توالی‌های مکمل خود روی رشته‌های قالب متصل شوند. این مرحله، دقت پرایمرها در اتصال به ناحیه هدف را تعیین می‌کند.

  3. گسترش (Extension):
    در دمای ۷۲ درجه‌ی سانتی‌گراد، آنزیم Taq polymerase از محل پرایمرها آغاز کرده و با افزودن dNTPها، رشته‌ی مکمل DNA را سنتز می‌کند.

این سه مرحله، یک چرخه‌ی کامل PCR را تشکیل می‌دهند. با تکرار این چرخه برای ۲۵ تا ۳۵ بار، تعداد نسخه‌های DNA هدف به‌صورت نمایی افزایش می‌یابد و در پایان واکنش، میلیون‌ها کپی از ناحیه مورد نظر تولید می‌گردد.

اصول PCR پی سی ار ژنتیک ژن زیست

منابع

  1. Rahman, M. T., Uddin, M. S., Sultana, R., Moue, A., & Setu, M. (2013). Polymerase chain reaction (PCR): a short review. Anwer Khan Modern Medical College Journal, 4(1), 30-36. بازیابی‌شده از https://www.banglajol.info/index.php/AKMMCJ/article/view/13682
  2. Zhu, H., Zhang, H., Xu, Y., Laššáková, S., Korabečná, M., & Neužil, P. (2020). PCR past, present and future. Biotechniques, 69(4), 317-325. بازیابی‌شده از https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32815744/
  3. Erlich, H. A. (1989). PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification. Stockton Press. بازیابی‌شده از https://link.springer.com/book/10.1007/978-1-349-20235-5

دیدگاه‌ خود را بنویسید