وسترن بلات: تاریخچه، اصول و تکنیکهای پیشرفته
وسترن بلات که با نامهای «پروتئین بلاتینگ» یا «ایمونوبلاتینگ» نیز شناخته میشود، روشی مهم و کارآمد برای شناسایی پروتئینها، بهویژه پروتئینهای کمفراوانی است. از زمان معرفی پروتکل انتقال پروتئین از ژل الکتروفورز به غشا در سال ۱۹۷۹، این تکنیک بهطور چشمگیری توسعه یافته است. در این مقاله، به بررسی روشهای مختلف انتقال پروتئین از ژل به غشا پرداخته میشود؛ این روشها بر پایه اصولی مانند انتشار ساده، جریان حلال به کمک خلأ و انتقال الکتروفورتیک عمل میکنند. در پایان نیز مروری کوتاه بر روشهای رایج برای شناسایی آنتیژنها روی بلاتها ارائه خواهد شد.
مقدمه: از ساترن تا وسترن
وسترن بلاتینگ یک روش آزمایشگاهی است که برای شناسایی پروتئینها به کار میرود. این روش در واقع ادامه و تکامل روشهای قبلی است: ساترن بلاتینگ که برای DNA استفاده میشد و نورترن بلاتینگ که برای RNA به کار میرفت. نام «وسترن بلاتینگ» هم برای حفظ همین سبک نامگذاری انتخاب شد.
در این روش، پروتئینها ابتدا با استفاده از ژل الکتروفورز بر اساس اندازه جدا میشوند. سپس این پروتئینها از داخل ژل به یک غشا (مثل کاغذ نیتروسلولز) منتقل میشوند. این غشا مثل یک کپی دقیق از ژل عمل میکند و تمام پروتئینهای جدا شده روی آن قرار میگیرند.
بعد از انتقال، میتوان با کمک آنتیبادیها (مولکولهایی که مخصوص پروتئینهای خاص هستند) پروتئین مورد نظر را پیدا و شناسایی کرد. این کار یک تحول بزرگ در علم ایمنیشناسی و زیستشناسی ایجاد کرد، چون قبل از آن دسترسی به پروتئینهای جداشده داخل ژل بسیار سخت بود. به همین دلیل، وسترن بلاتینگ به یکی از پرکاربردترین روشها در پژوهشهای زیستی و بیوشیمی تبدیل شده است.
در روش وسترن بلاتینگ، پروتئینهایی که ابتدا با ژل الکتروفورز (PAGE) از هم جدا شدهاند، به یک غشای مخصوص منتقل میشوند. این کار روشی بسیار قدرتمند برای شناسایی و بررسی ویژگیهای پروتئینهاست، بهخصوص پروتئینهایی که مقدارشان در نمونه خیلی کم است.
این روش چند مزیت مهم دارد:
غشاهایی که پروتئین روی آن منتقل میشود، نرم و انعطافپذیر هستند و به راحتی میتوان با آنها کار کرد.
پروتئینهای تثبیتشده روی غشا بهطور یکنواخت پخش میشوند و به راحتی در دسترس مولکولهای شناساییکننده مثل آنتیبادیها قرار میگیرند.
برای شناسایی پروتئینها به مقدار کمی مواد شیمیایی نیاز است.
میتوان از یک ژل، چندین کپی تهیه کرد.
الگوهای پروتئینی منتقلشده روی غشا را میتوان برای مدت طولانی نگهداری کرد و هر زمان لازم بود مورد استفاده قرار داد.
یک غشا با پروتئین منتقلشده میتواند برای چندین آزمایش مختلف پشت سر هم استفاده شود.
از زمان معرفی این روش، وسترن بلاتینگ همیشه در حال پیشرفت بوده و امروزه ابزارها و روشهای گوناگونی برای انتقال و شناسایی پروتئینها در اختیار پژوهشگران قرار دارد.
بخش اول: کارایی بلاتینگ و انتخاب غشا
انتقال پروتئینها از ژل به غشا (بلاتینگ) تحت تأثیر عواملی مانند نوع ژل، اندازه پروتئینها و جنس غشا قرار دارد. ژلهای نرمتر با درصد کمتر آکریلآمید و ماده اتصالدهنده، انتقال بهتری را فراهم میکنند، به شرطی که توان تفکیک پروتئینها حفظ شود. همچنین ژلهای نازکتر انتقال سریعتر و کاملتری دارند، هرچند ژلهایی نازکتر از حدود ۰.۴ میلیمتر کار با آنها دشوار است.
پروتئینهای با وزن مولکولی بالا پس از جداسازی با SDS-PAGE به سختی به غشا منتقل میشوند و در نتیجه شناسایی آنها در وسترن بلات محدود است. برای بهبود انتقال این پروتئینها میتوان از گرما، بافرهای ویژه یا هضم جزئی پروتئینها پیش از انتقال استفاده کرد.
مقایسه انواع غشاه
نیتروسلولز رایجترین نوع غشا در وسترن بلات است، اما محدودیتهایی هم دارد. پروتئینها روی این غشا به صورت کووالانسی متصل نمیشوند و همین باعث میشود پایداری اتصال پایین باشد. علاوه بر این، نیتروسلولز در حالت خشک شکننده است. پروتئینهای کوچک نیز معمولاً از منافذ غشا عبور میکنند و تنها مقدار کمی از آنها به غشا متصل میشود. برای کاهش این مشکل، میتوان از غشاهایی با منافذ کوچکتر استفاده کرد.
برای بهبود نگهداری پروتئینها، از نیتروسلولز پوشیدهشده با ژلاتین استفاده میشود. همچنین در نیتروسلولزهای تقویتشده (مانند Hybond-C extra) با افزودن یک لایه پشتیبان پلیاستری، استحکام مکانیکی غشا افزایش یافته و کار کردن با آن راحتتر میشود.
غشاهای PVDF (پلیوینیلیدن دیفلوراید) به دلیل ظرفیت بالای اتصال پروتئین، مقاومت مکانیکی خوب و پایداری شیمیایی، نسبت به سایر غشاها مزیت دارند. یکی از مهمترین ویژگیهای این غشاها این است که میتوان پروتئینهای منتقلشده را برای کاربردهای متنوعی استفاده کرد؛ مانند تعیین توالی بخش N-ترمینال پروتئین، جداسازی پپتیدها پس از هضم آنزیمی پروتئین، یا حتی تعیین توالی بخشهای داخلی پروتئین، علاوه بر تحلیل وسترن بلات.
برخلاف غشاهای نیتروسلولز که قابلیت رنگآمیزی با کوماسی بریلیانت بلو (CBB) را ندارند، غشاهای PVDF را میتوان با این رنگ رنگآمیزی کرد. این ویژگی اجازه میدهد تا پروتئینهای مورد نظر روی غشا مشخص و برش داده شوند و سپس برای تعیین توالی N-ترمینال مورد استفاده قرار گیرند.
کاغذهای فعالشده (دارای گروههای دیازو) پروتئینها را بهصورت کووالانسی به خود متصل میکنند. این ویژگی باعث میشود اتصال پروتئینها پایدارتر از غشاهای معمولی باشد. با این حال، این نوع کاغذ معایبی هم دارد. روش اتصال آن با بسیاری از سیستمهای الکتروفورز ژل سازگار نیست، چون اتصال از طریق گروههای آمینی اولیه انجام میشود. بنابراین فقط در سیستمهایی قابل استفاده است که در بافر ژل آنها، گروههای آمینه آزاد وجود نداشته باشد.
از طرف دیگر، این کاغذ نسبتاً گران است و گروههای فعال موجود روی آن بعد از آمادهسازی، عمر محدودی دارند و به مرور خاصیت خود را از دست میدهند.
غشاهای نایلونی از نظر استحکام مکانیکی بسیار مقاوم هستند، اما ظرفیت اتصال آنها برای پروتئین پایین است و به همین دلیل برای بیشتر کاربردهای وسترن بلات مناسب نیستند. برای رفع این مشکل، نوعی نایلون فعالشده با بار مثبت ساخته شده است که میتواند پروتئینها را بهتر نگه دارد، ولی در عوض میزان اتصال غیراختصاصی در آن بیشتر میشود.
به همین دلیل، با وجود گزینههای مختلف، همچنان غشاهای نیتروسلولز در بسیاری از شرایط انتخاب اصلی و بهترین گزینه به شمار میآیند.
بخش دوم: تکنیکهای انتقال پروتئین از ژل به غشا
انتقال پروتئین از ژلهای طبیعی یا SDS-PAGE به غشاهای نیتروسلولز یا PVDF به سه روش مختلف انجام میشود:
انتشار ساده (Simple diffusion)
جریان حلال با کمک خلاء (Vacuum-assisted solvent flow)
وسترن بلاتینگ یا شستشوی الکتروفورتیک (Western blotting or electrophoretic elution)
انتشار ساده (Diffusion blotting) یکی از اولین روشهایی بود که برای انتقال پروتئینها از ژلهای نازک (پس از ایزوالکتریک فوکوسینگ) به غشا به کار رفت و بعدها در سایر انواع ژل هم استفاده شد. در این روش، غشا روی سطح ژل قرار میگیرد و چند لایه کاغذ صافی خشک روی آن گذاشته میشود. سپس یک صفحه شیشهای و جسمی سنگین روی مجموعه قرار میگیرند تا انتقال پروتئینها به کمک فرآیند انتشار انجام شود.
این روش به دلیل بازده پایین در انتقال پروتئین، ابتدا کاربرد گستردهای پیدا نکرد. اما زمانی که مشخص شد میتوان با قرار دادن ژل بین دو غشا تا ۱۲ نسخه بلات از یک ژل به دست آورد، دوباره مورد توجه قرار گرفت.
بزرگترین مزیت انتشار ساده نسبت به الکتروبلاتینگ این است که امکان گرفتن چندین کپی از یک ژل وجود دارد و میتوان همان پروتئینها را با آنتیبادیهای مختلف بررسی کرد. البته راندمان انتقال در این روش فقط حدود ۲۵ تا ۵۰ درصد الکتروبلاتینگ است. با این حال، داشتن چندین نسخه از یک ژل میتواند این محدودیت را جبران کند، بهویژه اگر از روشهای حساس شناسایی پروتئین استفاده شود.
بلاتینگ با خلاء (Vacuum blotting) روشی است که بهعنوان جایگزینی برای انتشار ساده و الکتروبلاتینگ معرفی شد. در این روش، یک پمپ مکش که به سیستم خشککننده ژل متصل است، نیروی لازم را ایجاد میکند تا پروتئینهای جداشده از ژل به غشای نیتروسلولز منتقل شوند.
مزیت این روش این است که میتوان هم پروتئینهای با وزن مولکولی بالا و هم پروتئینهای کوچک را منتقل کرد. البته در مورد پروتئینهای کوچک باید از غشاهای نیتروسلولز با منافذ ریزتر (۰.۲ یا ۰.۱ میکرومتر) استفاده شود، چون پروتئینهای کوچکتر (حدود ۱۴ کیلو دالتون) به خوبی توسط غشاهای با منافذ بزرگتر مثل ۰.۴۵ میکرومتر جذب نمیشوند.
الکتروبلاتینگ (Electroblotting) رایجترین و پرکاربردترین روش برای انتقال پروتئینها از ژل به غشا است. مهمترین مزیتهای آن نسبت به انتشار ساده یا بلاتینگ با خلاء، سرعت بالا و انتقال کاملتر پروتئینها است.
انتقال الکتریکی به دو شیوه انجام میشود:
انتقال مرطوب (Wet transfer): در این روش، ژل و غشا به همراه الکترودها بهطور کامل درون یک مخزن بافر غوطهور میشوند.
انتقال نیمهخشک (Semi-dry transfer): در این حالت، ژل و غشا بین دو صفحه الکترود کربنی قرار میگیرند و کاغذهای جاذب آغشته به بافر اطراف آنها گذاشته میشود.
مزایای انتقال نیمهخشک:
امکان انتقال چندین ژل به صورت همزمان وجود دارد.
استفاده از الکترودهای کربنی ساده و ارزان امکانپذیر است.
انرژی کمتری نسبت به روش مرطوب مصرف میشود.
بخش سوم: تغییرات و روشهای پیشرفته الکتروبلاتینگ
پروتکلهای متعددی از روش اصلی الکتروبلاتینگ توسعه یافتهاند که بر بهبود پروتکل اصلی با تمرکز بر افزایش میزان پروتئین منتقل شده و حفظ شده روی غشا متمرکز هستند.
بلاتینگ دوگانه (Double Blotting):
برای کاهش خطاهای ناشی از اتصال غیراختصاصی آنتیبادی، ابتدا پروتئینها روی یک غشا منتقل میشوند و سپس آنتیبادی اولیه روی غشای دوم منتقل میشود تا دقت بالاتر رود.اسلایس بلاتینگ (Slice Blotting):
برای بررسی آزاد شدن موادی مثل سیتوکینها یا فاکتورهای رشد از بافتهایی مثل مغز استفاده میشود.پرینت بافت (Tissue Printing):
در این روش، بافت تازه (مثل برگ یا ساقه) مستقیماً روی غشا فشرده میشود و پروتئینها به غشا منتقل میشوند.الکتروفورز طبیعی و وسترن بلاتینگ (NEWeB):
پروتئینها در شرایطی جدا میشوند که ساختار طبیعی و فعالیت زیستیشان حفظ شود.گرید ایمونوبلاتینگ (Grid-Immunoblotting):
امکان بررسی همزمان ۲۰ نمونه مختلف برای آنتیبادیها و آنتیژنهای متفاوت روی یک غشا.سنجش بلاتینگ آنتیژن چندگانه (MABA):
میتوان تا ۲۸ آنتیژن مختلف (مثلاً پپتیدهای سنتتیک) را روی یک غشا آزمایش کرد.وسترن بلاتینگ با بافت چندگانه (MTW):
مقایسه سطح پروتئینها در بافتهای مختلف (مثل بافتهای انسانی) برای بررسی بیان ژنی.سنجش ایمونوبلات نقطهای (Dot-Iba):
آنتیژنها به صورت نقطهای روی دیسکهای نیتروسلولز قرار داده میشوند و سپس با آنتیبادی واکنش میدهند.بلاتینگ با کارایی بالا برای پروتئینهای سنگین:
یک روش جدید که امکان انتقال سریع و کامل پروتئینهای با جرم مولکولی بالا و پایین را فراهم میکند.وسترن بلاتینگ با کیتهای تجاری:
کیتهای آماده مثل Multi-blot کار را سادهتر و سریعتر میکنند.انتقال الکتریکی دو مرحلهای:
پروتئینها در دو مرحله متوالی منتقل میشوند تا دقت و کارایی در مورد پروتئینهای با اندازههای مختلف افزایش یابد.استفاده از کمپلکسهای ایمنی پلیمری:
باعث کاهش لکهگذاری پسزمینه و افزایش دقت و حساسیت میشود.بلاتینگ با اولتراسوند:
با کمک امواج فراصوت، انتقال پروتئین فقط در ۳ دقیقه انجام میشود.ایسترن بلاتینگ (Eastern Blotting):
نوع خاصی از بلاتینگ که پروتئینها با مادهای متفاوت (CTAB) جدا میشوند.بلاتینگ پروتئینهای رنگآمیزیشده با کوماسی (CBB):
پروتئینهایی که قبلاً با رنگ CBB رنگآمیزی شدهاند هم میتوانند بعداً به غشا منتقل شوند.خالصسازی پپتیدهای تریپتیک:
با استفاده از غشای PVDF، پپتیدهای حاصل از هضم تریپسین قبل از طیفسنجی جرمی خالصسازی میشوند.بهبود شناسایی با تیمار غشا:
مواد مختلفی مثل شیر یا شویندهها میتوانند پروتئینهای مزاحم را از غشا جدا کنند و وضوح نتایج را بهتر کنند.
بخش چهارم: شناسایی آنتیژن
پروتئینها روی ایمونوبلاتها میتوانند به صورت مستقیم توسط رنگهای آلی (پونسو قرمز، آمیدو بلک، فست گرین و CBB)، برچسبهای فلورسنت، روشهای مختلف رنگآمیزی با نقره و ذرات کلوئیدی مانند طلا، نقره، مس، آهن یا جوهر هندی شناسایی شوند.
Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting
https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC3456489/Western Blotting a review: Principle, protocol and problem solving (2023)
https://gsconlinepress.com/journals/gscarr/content/western-blotting-review-principle-protocol-and-problem-solvingWestern Blot – StatPearls (2023)
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK542290/
