راهنمای اصول کشـت سـلولی بخش ۲ - آلودگی زیستی
مقدمه
آلودگی کشت‌های سلولی به‌راحتی شایع‌ترین مشکل در آزمایشگاه‌های کشت سلولی است که گاهی عواقب بسیار جدی به دنبال دارد. آلاینده‌های کشت سلولی به دو دسته اصلی تقسیم می‌شوند: آلاینده‌های شیمیایی مانند ناخالصی‌های موجود در محیط‌ها، سرم‌ها، و آب، اندوتوکسین‌ها، پلاستی‌سایزرها، و مواد شوینده، و آلاینده‌های زیستی مانند باکتری‌ها، کپک‌ها، مخمرها، ویروس‌ها، مایکوپلاسما، و همچنین آلودگی متقاطع توسط سایر خطوط سلولی. اگرچه حذف کامل آلودگی غیرممکن است، می‌توان با درک کامل منابع آن‌ها و رعایت تکنیک‌های آسپتیک مناسب، دفعات و شدت آن را کاهش داد. این بخش مروری بر انواع اصلی آلودگی زیستی ارائه می‌دهد.
باکتری‌ها
باکتری‌ها گروه بزرگی از میکروارگانیسم‌های تک‌سلولی هستند که در همه جا حضور دارند. آن‌ها معمولاً چند میکرومتر قطر دارند و می‌توانند اشکال مختلفی از جمله کره، میله، و مارپیچ داشته باشند. به دلیل فراوانی، اندازه، و سرعت رشد سریع، باکتری‌ها، همراه با مخمرها و کپک‌ها، شایع‌ترین آلاینده‌های زیستی در کشت سلولی هستند. آلودگی باکتریایی به‌راحتی با بازرسی بصری کشت در عرض چند روز پس از آلوده شدن قابل تشخیص است؛ کشت‌های آلوده معمولاً کدر (یعنی تیره) به نظر می‌رسند و گاهی اوقات یک لایه نازک روی سطح آن‌ها تشکیل می‌شود. کاهش ناگهانی pH محیط کشت نیز اغلب مشاهده می‌شود. تحت میکروسکوپ با توان پایین، باکتری‌ها به‌صورت دانه‌های کوچک و متحرک بین سلول‌ها ظاهر می‌شوند، و مشاهده تحت میکروسکوپ با توان بالا می‌تواند اشکال تک‌تک باکتری‌ها را مشخص کند. تصاویر شبیه‌سازی‌شده زیر یک کشت چسبنده ۲۹۳ سلولی آلوده به E. coli را نشان می‌دهند.
تصاویر شبیه‌سازی‌شده فاز کنتراست از سلول‌های چسبنده ۲۹۳ آلوده به E. coli. فضاهای بین سلول‌های چسبنده دانه‌های کوچک و درخشان را تحت میکروسکوپی با توان پایین نشان می‌دهند، اما باکتری‌های منفرد به‌راحتی قابل تشخیص نیستند (پنل A). بزرگنمایی بیشتر از ناحیه محصور شده توسط مربع سیاه، سلول‌های منفرد E. coli را با بزرگنمایی ۲۰۰۰ برابر مشخص می‌کند (پنل B).
مطالعه راهنمای اصول کشت سلولی – بخش ۱ در تیوان ژن
مخمرها
مخمرها میکروارگانیسم‌های تک‌سلولی یوکاریوتی در قلمرو قارچ‌ها هستند که اندازه آن‌ها معمولاً از چند میکرومتر تا به ندرت ۴۰ میکرومتر متغیر است. مانند آلودگی باکتریایی، کشت‌های آلوده به مخمر کدر می‌شوند، به‌ویژه اگر آلودگی در مرحله پیشرفته باشد. تغییر بسیار کمی در pH کشت آلوده به مخمر تا زمانی که آلودگی سنگین شود، مشاهده می‌شود، در این مرحله pH معمولاً افزایش می‌یابد. تحت میکروسکوپی، مخمرها به‌صورت ذرات بیضی یا کروی منفرد ظاهر می‌شوند که ممکن است ذرات کوچک‌تری را جوانه بزنند. تصویر شبیه‌سازی‌شده زیر یک کشت چسبنده ۲۹۳ سلولی را ۲۴ ساعت پس از کاشت که به مخمر آلوده شده است، نشان می‌دهد.
تصاویر شبیه‌سازی‌شده فاز کنتراست از سلول‌های ۲۹۳ در کشت چسبنده که به مخمر آلوده شده‌اند. سلول‌های مخمر آلاینده به‌صورت ذرات بیضی ظاهر می‌شوند که در حال جوانه زدن ذرات کوچک‌تر در حین تکثیر هستند.
کپک‌ها
کپک‌ها میکروارگانیسم‌های یوکاریوتی در قلمرو قارچ‌ها هستند که به‌صورت رشته‌های چندسلولی به نام هیف رشد می‌کنند. شبکه‌ای متصل از این رشته‌های چندسلولی حاوی هسته‌های ژنتیکی یکسان است و به‌عنوان یک کلونی یا میسلیوم شناخته می‌شود. مشابه آلودگی مخمر، pH کشت در مراحل اولیه آلودگی پایدار باقی می‌ماند، سپس با شدت گرفتن عفونت به‌سرعت افزایش می‌یابد و کشت کدر می‌شود. تحت میکروسکوپی، میسلیوم‌ها معمولاً به‌صورت رشته‌های نازک و مواج ظاهر می‌شوند، و گاهی به‌صورت توده‌های متراکم‌تر از هاگ‌ها. هاگ‌های بسیاری از گونه‌های کپک می‌توانند در شرایط بسیار سخت و نامناسب در مرحله خواب خود زنده بمانند و تنها زمانی که با شرایط رشد مناسب مواجه شوند، فعال شوند.
ویروس‌ها
ویروس‌ها عوامل عفونی میکروسکوپی هستند که ماشین‌آلات سلول میزبان را برای تکثیر تسخیر می‌کنند. اندازه بسیار کوچک آن‌ها تشخیص آن‌ها را در کشت دشوار می‌کند و حذف آن‌ها از معرف‌های مورد استفاده در آزمایشگاه‌های کشت سلولی چالش‌برانگیز است. از آنجا که اکثر ویروس‌ها نیازهای بسیار سخت‌گیرانه‌ای برای میزبان خود دارند، معمولاً روی کشت‌های سلولی از گونه‌های غیر از میزبان خود تأثیر منفی نمی‌گذارند. با این حال، استفاده از کشت‌های سلولی آلوده به ویروس می‌تواند خطر جدی برای سلامت پرسنل آزمایشگاه ایجاد کند، به‌ویژه اگر سلول‌های انسانی یا نخستی‌ها در آزمایشگاه کشت شوند. آلودگی ویروسی کشت‌های سلولی را می‌توان با میکروسکوپی الکترونی، ایمونوستینینگ با پنل آنتی‌بادی‌ها، آزمایش‌های ELISA، یا PCR با پرایمرهای ویروسی مناسب تشخیص داد.
مایکوپلاسما
مایکوپلاسما باکتری‌های ساده‌ای هستند که فاقد دیواره سلولی هستند و به‌عنوان کوچک‌ترین ارگانیسم خودتکثیر شناخته می‌شوند. به دلیل اندازه بسیار کوچک آن‌ها (معمولاً کمتر از یک میکرومتر)، مایکوپلاسما تا زمانی که به چگالی بسیار بالایی نرسند و باعث تخریب کشت سلولی شوند، به‌سختی قابل تشخیص هستند؛ تا آن زمان، اغلب هیچ نشانه قابل مشاهده‌ای از عفونت وجود ندارد. برخی از مایکوپلاسماهای با رشد آهسته ممکن است بدون ایجاد مرگ سلولی در کشت باقی بمانند، اما می‌توانند رفتار و متابولیسم سلول‌های میزبان را در کشت تغییر دهند. عفونت‌های مزمن مایکوپلاسما ممکن است با کاهش نرخ تکثیر سلولی، کاهش چگالی اشباع، و آگلوتیناسیون در کشت‌های سوسپانسیون ظاهر شوند؛ با این حال، تنها راه مطمئن برای تشخیص آلودگی مایکوپلاسما، آزمایش دوره‌ای کشت‌ها با استفاده از رنگ‌آمیزی فلورسنت (مانند Hoechst 33258)، ELISA، PCR، ایمونوستینینگ، اتورادیوگرافی، یا آزمایش‌های میکروبیولوژیکی است.
فتومیکروگراف‌های سلول‌های کشت‌شده عاری از مایکوپلاسما (پنل A) و سلول‌های آلوده به مایکوپلاسما (پنل‌های B و C). کشت‌ها با استفاده از کیت تشخیص مایکوپلاسما MycoFluor™ آزمایش شدند، طبق پروتکل‌های کیت. در سلول‌های ثابت‌شده، معرف MycoFluor™ به هسته‌های سلولی دسترسی دارد، که به‌شدت با معرف رنگ‌آمیزی شده‌اند، اما عدم وجود اشیاء فلورسنت خارج هسته‌ای نشان‌دهنده عاری بودن کشت از آلودگی مایکوپلاسما است (پنل A). در سلول‌های آلوده (پنل‌های B و C)، اشیاء فلورسنت خارج هسته‌ای حضور مایکوپلاسما را نشان می‌دهند.
آلودگی متقاطع
اگرچه آلودگی متقاطع به اندازه آلودگی میکروبی شایع نیست، آلودگی گسترده بسیاری از خطوط سلولی با HeLa و سایر خطوط سلولی با رشد سریع یک مشکل کاملاً شناخته‌شده با عواقب جدی است. دریافت خطوط سلولی از بانک‌های سلولی معتبر، بررسی دوره‌ای ویژگی‌های خطوط سلولی، و رعایت تکنیک‌های آسپتیک مناسب، روش‌هایی هستند که به شما کمک می‌کنند از آلودگی متقاطع جلوگیری کنید. اثر انگشت DNA، تحلیل کاریوتایپ، و تحلیل ایزوتایپ می‌توانند حضور یا عدم حضور آلودگی متقاطع در کشت‌های سلولی شما را تأیید کنند.
استفاده از آنتی‌بیوتیک‌ها
آنتی‌بیوتیک‌ها نباید به‌صورت روتین در کشت سلولی استفاده شوند، زیرا استفاده مداوم آن‌ها باعث تشویق ایجاد سویه‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک می‌شود و اجازه می‌دهد آلودگی‌های سطح پایین ادامه یابند، که ممکن است پس از حذف آنتی‌بیوتیک از محیط به آلودگی کامل تبدیل شوند و همچنین می‌توانند عفونت‌های مایکوپلاسما و سایر آلاینده‌های مخفی را پنهان کنند. علاوه بر این، برخی آنتی‌بیوتیک‌ها ممکن است با سلول‌ها واکنش متقابل داشته باشند و در فرآیندهای سلولی مورد بررسی تداخل ایجاد کنند.
آنتی‌بیوتیک‌ها باید تنها به‌عنوان آخرین راه‌حل و فقط برای کاربردهای کوتاه‌مدت استفاده شوند، و باید هرچه سریع‌تر از کشت حذف شوند. در صورت استفاده طولانی‌مدت، کشت‌های بدون آنتی‌بیوتیک باید به‌صورت موازی به‌عنوان کنترل برای عفونت‌های مخفی نگهداری شوند.
منابع و رفرنس‌ها
- Freshney, R. I. (2010). Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (6th ed.). Wiley-Blackwell.
- Uphoff, C. C., & Drexler, H. G. (2013). Detection of mycoplasma contamination in cell cultures. Current Protocols in Molecular Biology, ۱۰۲(۱), ۲۸.۴.۱-۲۸.۴.۱۴. https://doi.org/10.1002/0471142727.mb2804s102
- Barone, P. W., Wiebe, M. E., Leung, J. C., & Hussein, I. T. M. (2020). Viral contamination in biologic manufacturing: A case study review. Biotechnology and Bioengineering, ۱۱۷(۳), ۸۹۰-۹۰۱. https://doi.org/10.1002/bit.27231
- Capes-Davis, A., Theodosopoulos, G., Atkin, I., Drexler, H. G., Kohara, A., MacLeod, R. A. F., … & Freshney, R. I. (2010). Check your cultures! A list of cross-contaminated or misidentified cell lines. International Journal of Cancer, ۱۲۷(۱), ۱-۸. https://doi.org/10.1002/ijc.25242
- Lincoln, C. K., & Gabridge, M. G. (1998). Cell culture contamination: Sources, consequences, prevention, and elimination. Methods in Cell Biology, ۵۷, ۴۹-۶۵. https://doi.org/10.1016/S0091-679X(08)61572-6
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC) and National Institutes of Health (NIH). (2009). Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) (5th ed.). U.S. Government Printing Office. https://www.cdc.gov/labs/BMBL.html
- Young, L., Sung, J., Stacey, G., & Masters, J. R. (2010). Detection of mycoplasma in cell cultures. Nature Protocols, ۵(۵), ۹۲۹-۹۳۴. https://doi.org/10.1038/nprot.2010.43
- Ryan, J. A. (2008). Understanding and Managing Cell Culture Contamination. Corning Incorporated. https://www.corning.com/media/worldwide/cls/documents/technical/CLS-CC-027.pdf
- Geraghty, R. J., Capes-Davis, A., Davis, J. M., Downward, J., Freshney, R. I., Knezevic, I., … & Nardone, R. M. (2014). Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. British Journal of Cancer, ۱۱۱(۶), ۱۰۲۱-۱۰۴۶. https://doi.org/10.1038/bjc.2014.166
- Nikfarjam, L., & Farzaneh, P. (2012). Prevention and detection of mycoplasma contamination in cell culture. Cell Journal (Yakhteh), ۱۳(۴), ۲۰۳-۲۱۲. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3584481/
