ترنسفکشن، انواع و روش‌های موجود- راهنمای فنی برای محققان زیستی (بخش ۱)
ترنسفکشن یکی از تکنیک‌های پیشرفته و مؤثر در زیست‌شناسی سلولی و مولکولی است که به‌کمک آن می‌توان اسیدهای نوکلئیک (DNA یا RNA خارجی) را به درون سلول‌های یوکاریوتی وارد کرد. این فرایند به پژوهشگران اجازه می‌دهد محتوای ژنتیکی سلول را تغییر دهند و از این طریق فرایندهای طبیعی سلولی، مکانیسم‌های بیماری‌ها و حتی اثرات درمانی ژن‌درمانی را مطالعه کنند.
در این مقاله، به بررسی جامع انواع روش‌های ترنسفکشن می‌پردازیم. همچنین مزایا، معایب، نوع اسید نوکلئیک وارد شده، کنترل‌های لازم و روش‌های ارزیابی کارایی ترنسفکشن را بر اساس مطالعات و منابع علمی معتبر مرور می‌کنیم.
با وجود تنوع بالای روش‌های موجود، انتخاب مناسب‌ترین پروتکل ترنسفکشن می‌تواند چالش‌برانگیز باشد؛ به‌ویژه برای پژوهشگرانی که به‌تازگی وارد این حوزه شده‌اند. هدف این راهنما، کمک به این دسته از پژوهشگران در تصمیم‌گیری آگاهانه برای انتخاب روش بهینه ترنسفکشن متناسب با اهداف آزمایشگاهی آن‌هاست.
ترنسفکشن چیست؟
ترنسفکشن (Transfection) فرآیندی است که طی آن، اسیدهای نوکلئیک خارجی مانند DNA یا RNA به درون سلول‌های یوکاریوتی وارد می‌شوند تا محتوای ژنتیکی سلول میزبان را تغییر دهند. این تکنیک از دهه ۱۹۹۰ تاکنون، به یکی از ابزارهای کلیدی در مطالعات سلولی، تحقیقات بیماری‌های ژنتیکی، و حتی ژن‌درمانی تبدیل شده است.
انواع ترنسفکشن: پایدار و گذرا
ترنسفکشن به‌طور کلی به دو نوع تقسیم می‌شود:
ترنسفکشن پایدار (Stable Transfection): در این روش، ژن خارجی وارد ژنوم سلول میزبان می‌شود یا در قالب پلاسمید در هسته باقی می‌ماند. این نوع ترنسفکشن برای مطالعات طولانی‌مدت و تولید انبوه پروتئین مناسب است.
ترنسفکشن گذرا (Transient Transfection): در این حالت، اسید نوکلئیک وارد سلول می‌شود اما در ژنوم ادغام نمی‌گردد. با تکثیر سلول، ژن خارجی نیز از بین می‌رود. این روش بیشتر برای مطالعات کوتاه‌مدت یا بررسی Knockdown/Knock-in ژن‌ها کاربرد دارد.
انتخاب ناقل: ویروسی یا غیر ویروسی؟
برای وارد کردن ماده ژنتیکی، معمولاً از ناقل‌هایی مانند ویروس‌ها یا پلاسمیدها استفاده می‌شود:
ناقل ویروسی: دارای توان بالا در انتقال ژن است اما ممکن است واکنش ایمنی در سلول میزبان ایجاد کند.
ناقل غیر ویروسی: مانند پلاسمیدها که ایمن‌تر هستند اما گاهی کارایی پایین‌تری دارند.
روش‌های انتقال به درون سلول
برای ورود مؤثر DNA یا RNA به درون سلول، باید از یکی از روش‌های انتقال استفاده شود. این روش‌ها شامل روش‌های فیزیکی (مثل الکتروپوریشن)، شیمیایی (مانند استفاده از لیپوزوم‌ها)، و بیولوژیکی هستند. در روش‌های شیمیایی، استفاده از حامل‌هایی مثل لیپیدها یا پلیمرها، اتصال ناقل به غشای سلول را تسهیل می‌کند.
چالش‌ها و انتخاب استراتژی مناسب
با توجه به تنوع بالای روش‌ها و گزینه‌ها، انتخاب پروتکل مناسب می‌تواند دشوار باشد. هدف این مرور، ارائه یک دید کلی از استراتژی‌ها، انواع اسید نوکلئیک مورد استفاده، روش‌های ارزیابی کارایی، و عوامل مؤثر بر موفقیت است تا محققان به‌ویژه تازه‌کارها بتوانند انتخاب هوشمندانه‌تری داشته باشند.
روش‌های ترنسفکشن: ویروسی، غیر ویروسی و هیبرید
واردسازی اسیدهای نوکلئیک به سلول‌های یوکاریوتی، از نظر روش اجرا به‌طور کلی به سه دسته اصلی تقسیم می‌شود:
روش‌های ویروسی (Viral)
روش‌های غیر ویروسی (Non-viral)
روش‌های ترکیبی یا هیبرید (Hybrid)
ترنسفکشن ویروسی چیست و چه کاربردی دارد؟
ترنسفکشن ویروسی، که با نام دقیق‌تر ترنسداکشن (Transduction) نیز شناخته می‌شود، روشی مؤثر برای وارد کردن توالی خاصی از اسید نوکلئیک (DNA یا RNA) به داخل سلول‌های یوکاریوتی است. در این روش، از ویروس‌های مهندسی‌شده به عنوان ناقل ژن استفاده می‌شود که ژن خارجی را به درون سلول میزبان منتقل می‌کنند.
ویروس‌های رایج
رتروویروس‌ها (مانند Lentivirus): عمدتاً برای انتقال پایدار (Stable Transfection) مورد استفاده قرار می‌گیرند؛ یعنی ژن وارد شده به‌طور دائمی در ژنوم سلول میزبان وارد می‌شود.
آدنوویروس‌ها، ویروس‌های آدنو-مرتبط (AAV) و ویروس هرپس: این ویروس‌ها معمولاً برای انتقال موقت (Transient) کاربرد دارند و ژن خارجی را بدون ادغام در ژنوم وارد سلول می‌کنند.
مزایا و معایب ترنسفکشن ویروسی
این روش به‌خصوص برای سلول‌های سخت‌گیر مانند سلول‌های اولیه (Primary Cells) که به سختی ترنسفکت می‌شوند، بسیار مؤثر است. اما در کنار کارایی بالا، ریسک‌های بالاتری همچون سمیت سلولی (Cytotoxicity) و احتمال بروز پاسخ‌های ایمنی یا التهاب نیز دارد.
از نظر ویژگی‌های ژنتیکی:
ژنوم آدنوویروس‌ها و هرپس‌ویروس‌ها به صورت DNA دو رشته‌ای است.
ژنوم AAV به صورت DNA تک‌رشته‌ای می‌باشد.
رتروویروس‌ها نیز RNA حمل می‌کنند که با آنزیم رونوشت‌بردار معکوس (Reverse Transcriptase) به DNA تبدیل شده و در ژنوم میزبان ادغام می‌شود.
| ویروس | نوع اسید نوکلئیک | ظرفیت انتقال | پایداری ترنسفکشن | ایمنی |
|---|---|---|---|---|
| Retrovirus | RNA → DNA | متوسط | پایدار | متوسط |
| Adenovirus | DNA دو رشته‌ای | بالا | موقت | بالا (التهاب‌زا) |
| AAV | DNA تک رشته‌ای | پایین (<5 kb) | موقت | ایمن‌تر |
| Herpes Virus | DNA دو رشته‌ای | بسیار بالا (~۱۵۰ kb) | موقت | دارای تمایل زیاد به سلول‌های عصبی |
AAV به دلیل ایمنی بیشتر، گزینه‌ی مناسب‌تری برای درمان‌های ژنی انسانی است، ولی ظرفیت انتقال محدود دارد.
آدنوویروس‌ها تقریباً همه‌ی انواع سلول‌ها را ترنسفکت می‌کنند.
ویروس هرپس به دلیل ظرفیت زیاد و تمایل بالا به سلول‌های عصبی، گزینه‌ای عالی برای درمان بیماری‌های سیستم عصبی است.
استفاده از رتروویروس‌ها با ریسک جهش‌های ناخواسته در ژنوم (Insertional Mutagenesis) همراه است.
ترنسفکشن غیر ویروسی با روش‌های فیزیکی: تکنیکی بدون ویروس اما چالش‌برانگیز
یکی از روش‌های مؤثر و بدون ویروس برای وارد کردن مواد ژنتیکی به درون سلول، استفاده از ترنسفکشن فیزیکی یا مکانیکی است. این روش‌ها بدون استفاده از ناقل ویروسی، مستقیماً ساختار سلول را برای پذیرش اسید نوکلئیک خارجی تحریک می‌کنند.
مهم‌ترین روش‌های فیزیکی ترنسفکشن
۱. الکتروپوریشن (Electroporation)
در این روش، با استفاده از ولتاژ الکتریکی، نفوذپذیری موقت غشای سلولی افزایش یافته و امکان ورود DNA یا RNA فراهم می‌شود. الکتروپوریشن به‌ویژه برای سلول‌های سخت‌گیر مانند سلول‌های بنیادی، اولیه یا لنفوسیت‌های B استفاده می‌شود.
مزیت: کارایی بالا در ترنسفکشن سلول‌های مقاوم
عیب: احتمال نکروز، آپوپتوز یا آسیب برگشت‌ناپذیر به سلول در صورت استفاده از ولتاژ بالا
۲. سونوپوریشن (Sonoporation)
در این روش، از امواج فراصوت و میکروحباب‌ها استفاده می‌شود تا منافذ موقتی در غشای سلول ایجاد شود و ورود مواد ژنتیکی آسان‌تر گردد.
خطر: تخریب غشای سلول و مرگ سلولی در صورت شدت زیاد امواج
۳. ترنسفکشن با لیزر (Laser Irradiation)
پرتو لیزر سوراخ‌های بسیار ریز در غشای پلاسمایی ایجاد می‌کند تا مسیر ورود به داخل سلول باز شود.
کاربرد: تحقیقات پیشرفته و تخصصی
نکته: خطر آسیب غیرقابل برگشت به سلول وجود دارد
۴. مگنتوفرکشن (Magnetofection)
در این روش از نیروی مغناطیسی برای هدایت اسیدهای نوکلئیک (معمولاً متصل به نانوذرات مغناطیسی) به درون سلول استفاده می‌شود.
ویژگی: نسبت به سایر روش‌های فیزیکی آسیب کمتری به سلول می‌زند اما بازدهی پایین‌تری دارد.
۵. میکرواینجکشن ژنی (Microinjection)
در این روش، با استفاده از سوزن میکروسکوپی، اسید نوکلئیک مستقیماً به داخل هسته سلول تزریق می‌شود. این تکنیک نیاز به اپراتور حرفه‌ای یا سیستم‌های روباتیک بسیار دقیق دارد.
کاربرد: درمان‌های ژنی و پروژه‌های حساس
مزیت: انتقال مستقیم ژن به هسته
نکته: خطر آسیب فیزیکی بالا در صورت اجرای نادرست
| روش | کارایی | خطر آسیب به سلول | نیاز به تجهیزات پیشرفته | مناسب برای |
|---|---|---|---|---|
| Electroporation | بالا | متوسط تا زیاد | متوسط | سلول‌های اولیه و سخت‌گیر |
| Sonoporation | متوسط | زیاد | متوسط | پروژه‌های تحقیقاتی |
| Laser | متوسط | زیاد | بالا | مطالعات تخصصی |
| Magnetofection | پایین | کم | پایین | روش ایمن برای مطالعات مقدماتی |
| Microinjection | بالا | زیاد | بسیار بالا | ژن‌درمانی، IVF |
مهم‌ترین روش‌های فیزیکی ترنسفکشن
یکی از روش‌های پرکاربرد در ورود مواد ژنتیکی به درون سلول‌های یوکاریوتی، استفاده از ترکیبات شیمیایی است. این تکنیک، بدون نیاز به ویروس یا روش‌های مکانیکی، با کمک مواد شیمیایی خاص فرآیند ترنسفکشن را تسهیل می‌کند.
دو نوع کلی ترنسفکشن شیمیایی
ترنسفکشن شیمیایی به طور کلی به دو دسته تقسیم می‌شود:
ترنسفکشن مبتنی بر لیپوزوم‌ها (Liposomal-based)
ترنسفکشن غیر لیپوزومی (Non-liposomal-based)
۱. ترنسفکشن مبتنی بر لیپوزوم‌ها
در این روش، از لیپیدهای دارای بار مثبت برای ساخت لیپوزوم‌هایی استفاده می‌شود که به‌راحتی با غشای فسفولیپیدی سلول میزبان ادغام می‌شوند. این ادغام باعث می‌شود مواد ژنتیکی خارجی به‌راحتی وارد سلول شوند.
مزایا:
ساده و پرکاربرد
بازدهی بالا
سمیت سلولی کم
۲. ترنسفکشن غیر لیپوزومی
این دسته شامل گروه‌های مختلفی از مواد شیمیایی است:
الف) کلسیم فسفات
یکی از ارزان‌ترین روش‌های شیمیایی است که از واکنش یون‌های کلسیم با اسید نوکلئیک استفاده می‌کند. این ترکیب رسوبی وارد سلول می‌شود.
نکته: موفقیت این روش پایین است و نیاز به بهینه‌سازی دارد.
ب) دندریمرها (Dendrimers)
دندریمرها مولکول‌های سه‌بعدی و شاخه‌دار هستند که با DNA یا RNA ترکیب می‌شوند. گفته می‌شود عملکرد بهتری نسبت به کلسیم فسفات دارند.
محدودیت: کارایی آن‌ها هنوز کمتر از روش‌های لیپوزومی و ویروسی است.
پ) پلیمرهای کاتیونی
پلیمرهای با بار مثبت می‌توانند با اسیدهای نوکلئیک ترکیب شده و از طریق اندوسیتوز وارد سلول شوند.
مزیت: سمیت سلولی پایین
عیب: بازدهی نسبتاً پایین
ت) نانوذرات (Nanoparticles)
نانوذرات به دلیل اندازه کوچک خود امکان ورود مؤثرتر مواد ژنتیکی به داخل سلول را فراهم می‌کنند.
نکته مهم: سمیت سلولی کم، اما برای کاربرد بالینی به تحقیقات بیشتری نیاز دارند.
ث) نانوحامل‌های غیر لیپوزومی
این‌ها حامل‌هایی هستند که با استفاده از لیپیدهای خاص ساخته شده‌اند و انتقال سریع و مؤثر مواد ژنتیکی را ممکن می‌کنند.
نکته: ایمن‌تر از لیپوزوم‌های سنتی، اما فرآیند ساخت آن‌ها پرهزینه و پیچیده است.
